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高考生物必备知识点:DNA的粗提取与鉴定一、实验原理
DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L时,DNA的溶解度最大,浓度为 0.14 mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于95%的酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA中含有脱氧核糖,能与二苯胺(沸水浴)反应生成蓝色物质,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
高考生物必备知识点:DNA的粗提取与鉴定二、目的要求
1. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法。
2. 观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。
材料用具
材料:活鸡或鲜血鸡血。
仪器:离心机、恒温水裕锅、载玻片,玻璃棒,滤纸,滴管,量简(100 mL,l个),烧杯(100 mL,l个,50 mL、500 mL各 2个),试管(20 mL,2个),漏斗,试管夹,纱布。
试剂:酒精的体积分数为95%的溶液(实验前置于冰箱内冷却24 h),蒸馏水,柠檬酸钠的质量浓度为 0.1g/mL的溶液,氯化钠的物质的量浓度分别为 2 mol/L和0.015 mol/L的溶液,二苯胺试剂。
高考生物必备知识点:DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤
实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成),制备的方法是:取柠檬酸钠的质量浓度为 0.1 g/mL的溶液(抗凝剂)100 mL,置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180 mL)注入烧杯中,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免凝血。然后,将血液倒入离心管内,用 1000 r/min的离心机离。2min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离。心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。
1.提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL~10mL,注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL,同时用玻璃棒充分搅拌5 min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。
2.溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶液40mL加入到滤液中,并摇动烧杯,使其混合均匀,这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3.析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol/L)。
4.滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中,含 DNA的粘稠物被留在纱布上。
5.将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃择不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6.过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中。
7.提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为 95%的溶液 50mL(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA 。注意观察丝状物是什么颜色的。
8.DNA的鉴定
取两支20 mL的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015 mol/L的溶液5 mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热 5 min,待试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。
高考生物必备知识点:DNA的粗提取与鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定实验原理
(1)粗提取原理:在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而降低;在0.14mol/L时,DNA的溶解度最小;当NaCl溶液浓度继续增加时,DNA溶解度又增大。
(2)纯化原理:DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
(3)鉴定DNA原理:在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
2.实验材料的选择及处理
(1)不选择猪血等哺乳动物的血液,因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
(2)需要在鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠溶液,防止血液凝固。
(3)需除去鸡血中的血浆,因为血浆中无DNA。
特别提醒:不同生物的组织中DNA含量不同在选取材料时,应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
3.生物实验过程
步骤:提取细胞核物质→溶解核内DNA→析出DNA粘稠物→滤取含DNA的粘稠物→DN A粘稠物的再溶解→过滤含有DNA的氯化钠溶液→提取含杂质较少的DNA→DNA的鉴定。
操作要点:(1)2次加蒸馏水:第一次是在是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充分搅拌使血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是为了稀释氯化钠溶液。
(2)3次加氯化钠溶液:第一次加氯化钠后,必须充分晃动烧杯,使二者混合均匀,加速染色质中DNA与蛋白质分离,使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中;第二次加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解,这时溶液中的蛋白质含量已很少;第三次加氯化钠溶液还是为溶解DNA。
(3)6次搅拌:除最后一次搅拌外前5次搅拌均朝一个方向:,并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中,各步搅拌都要轻缓玻璃棒,不要直插烧杯底部防止DNA分子断裂。
(4)3次过滤:第一次过滤,留滤液;第二次过滤,留粘稠物;第三次过滤,留滤液。注意这3次过滤都用纱布,获得沉淀物或粘稠物的通常为多层,获得滤液的纱布层数适当减少。
特别提醒:若以植物为实验材料,步骤上大致相同,在材料的处理上有几点不同:一是增加研磨步骤,目的是破坏细胞壁;二是加入洗涤剂,目的是溶解细胞膜及核膜;三是加食盐,可加速细胞膜及核膜的破裂。
4.DNA的粗提取与鉴定实验注意事项
(1)用冷酒精浓缩和沉淀DNA时所用的95%酒精,必须经过充分预冷后才能使用,冷酒精与含 DNA的氯化钠溶液体积比是2:1 。如果用冷酒精处理后,悬浮于溶液中的丝状物较少,可将混合液放于冰箱中再冷却几分钟,然后再用玻璃棒卷起丝状物。
(2)鸡血细胞破碎以后释放的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。
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